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TA克隆

簡要描述:TA克?。╟lone):無性繁殖——應用酶學的方法,在體外將目的基因與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子(重組子),再通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因轉化子,進行擴增、提取獲得大量同一DNA,或其表達產(chǎn)物。

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質:生產(chǎn)廠家
  • 更新時間:2024-05-13
  • 訪  問  量:5516

TA克隆實驗原理 

  TA克隆是利用耐熱聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校準活性,即在PCR產(chǎn)物的兩個3 末端加上未配對的單一A凸出尾 ,質粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

只需4個步驟:①擴增目的PCR產(chǎn)物;②制備T克隆載體;③PCR產(chǎn)物直接克隆至T載體上④轉化并篩選重組子。

 

實驗步驟

(1)擴增后的PCR產(chǎn)物與T載體的連接

取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產(chǎn)物約0.3 pmol

T載體約0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩爾數(shù)應控制在載體DNA摩爾數(shù)的3-10倍。

*2 相同末端的載體與DNA進行連接時,應首先將載體進行去磷酸化處理,以防止其自身環(huán)化。

(2)蓋好蓋子,用手指輕彈Ep管數(shù)次,并于臺式離心機離心2s 以集中溶液。

(3)將反應管放入4℃金屬浴中反應20h。

(4)取出約2ul的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳,鑒定連接結果,與未經(jīng)連接的質粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

(5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使用10ul轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。

(6)通過Amp抗性來篩選轉化子,轉化子擴增后,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑒定。

 

 

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